* Kvalitetsparametre for vurdering av en sekvensering omfatter en helhetsvurdering av tolkningsdata, se utvidet forklaring i tekstavsnitt Det henvises til andre prosjekter i NorPreM; Harmonisering av varianttolkning og bruk av tolkningsverktøy (P-1-008)1  for mer detaljert informasjon om tolkning av NGS.

Kvantitativ måling av DNA/RNA etter ekstraksjon er en kritisk del av molekylærbiologiske analyser, og valg av metode har stor betydning for nøyaktighet og anvendbarhet. Konsentrasjonsmåling med fluorometer er å foretrekke fremfor spektrofotometer da metoden binder fluorescerende fargestoffer spesifikt til nukleinsyrene, mens spektrofotometeret kun måler absorbert bølgelengde. NanoDrop (spektrofotometer) kan vise 2-10 ganger høyere konsentrasjon enn måling med Qubit (fluorometer),2  NanoDrop er i tillegg følsom for forstyrrende bakgrunns-signal i blank som kan gi kunstig høy konsentrasjon. Kvantitative målinger (fluorometriske eller spektrofotometriske) måler total nukleinsyre og tar ikke høyde for fragmentering av nukleinsyrene. Sterkt fragmenterte prøver med høy konsentrasjon, som fortynnes før NGS-analyse, kan gi falske negative resultater. En alternativmetode er å måle mengden nukleinsyrer ved ønsket fragmentlengde ved hjelp av qPCR eller digitaldråpe PCR (ddPCR).34

Ulike metoder for bibliotekspreparering, og varierende prøvekvalitet kan gi ulik kvalitet og mengde templat for sekvensering. Erfaringer fra laboratorier viser at konsentrasjonen på ferdig bibliotek varierer i forhold til hva produsent har satt av forventet optimal konsentrasjon. Kvantitering av bibliotek kan sikre mengden input av bibliotek inn i sekvenseringsreaksjonen. Kvantifisering kan gjøres ved fluorometer og elektroforese, evt. ved bruk av qPCR-kit avhengig at hvilke kit som er brukt til biblioteksprepararing.

Fragmenteringsgrad av nukleinsyre bør alltid evalueres ved validering av nye NGS metoder. Kvalitet på utbytte og input av DNA/RNA materiale kan kontrolleres med ulike metoder, listet opp i tabellen, og forklart ytterligere i punktene under.  Metodene er et utvalg fra laboratoriets rutiner, men også hva som foreligger på markedet anno 2025:

• Analyse av fragmenteringsgrad ved qPCR.
  • Måling av mengde amplifisert human genom ekvivalent (HGE) i hver prøve ved inkorporering av unike molekylære indekser (UMI). Dette måler kompleksiteten til hvert bibliotek.4
  • Q- ratio estimert med assay fra Kapa Biosystems. Forholdet mellom mengden amplifisert produkt ved forskjellige fragmentlengder gir en Q-ratio. Lavere ratio indikerer mer fragmentert materiale.5
  • Infinium HD FFPE QC assay control kit for DNA fra Illumina.6
• Analyse av fragmenteringsgrad ved elektroforese assays
  • Kommersielle fragmentlengde assays som f.eks. TapeStation eller Bioanalyzer. Kvalitetsmål kan være DV200 Index (prosent av fragmenter > 200bp lengde).7

Uegnet DNA/RNA fra FFPE-materiale, blant annet grunnet fragmentering, viser seg som ikke uniform coverage på tvers av amplikon, såkalt coverage bias. For enkelte sekvenseringspanel vil prøven også ha en høy MAPD verdi (Median av Alle Parvise Forskjeller) i prøvens sekvensering. Det kan benyttes bioinformatiske verktøy for å vurdere deknings uniformitet som et mål på fragmentering av NGS-data f.eks. fold 80 base penalty. Dette verktøyet kan brukes på større genpanel.8 Enkelte paneler som f.eks. Genexus DX Express Test har egen internkontroll for fragmenteringsgrad.

Det er viktig og alltid gå gjennom kvalitetsparametrene på enkeltprøver etter endt sekvensering/NGS-analyse for å påse at kvalitetsparameter-kriterier er oppfylt.

DNA/RNA-konsentrasjon alene angir ikke kvaliteten på materialet. Det er viktig å vurdere både konsentrasjon, tumorandel og eventuelt fragmenteringsgrad. Det anbefales og følge leverandørs anbefalinger ift. konsentrasjon, input –mengde og tumorandel, eller gjør egen validering. Se kapittel, Vurdering og utvelgelse av prøvemateriale, for kriterier som kan påvirke tumorandel i sekvensering og kvaliteten av dette.

Bruk av materiale med lav tumorandel og/eller lav konsentrasjon øker risikoen for både falske negative og falske positive resultater. Når tumorandel er lav kan det oppstå falske negative resultater ved at reelle varianter mistolkes som artefakter, eller at varianten forsvinner under amplifisering. Ved fusjonsanalyse av RNA kan det danne seg uspesifikke artefakter som f.eks. høye avlesninger i RNA ekson varianter som er sjeldne (mulig falske positive). Lav tumorandel kan også føre til overestimering av kopitallsvariasjon, som igjen kan gi opphav til falske positive funn. Dersom tumorandelen til prøven har blitt feilestimert f.eks. på grunn av høy andel inflammatoriske celler, kan det føre til feilaktige konklusjoner. Drivermutasjoner har ofte høyere allelfrekvens. Påvisning av slike mutasjoner med lav allelfrekvens, kombinert med fravær av øvrige funn, kan indikere lav tumorandel, utilstrekkelig input mengde eller lav dekning.

Kvalitetsparametre for vurdering av om en sekvensering er av tilstrekkelig kvalitet omfatter en helhetsvurdering av tolkningsdata blant annet følgende parametre:

• Histogram over fragmentlengde,
• God mapped reads DNA og fusion reads for RNA,
•  Tilstrekkelig sekvenseringsdybde (også dekning av enkelt gener/områder i analysepakke),
• Lavt antall NO CALL i en prøve (forklaring under)
• Lite varierende eller dårlig coverage på referanse områder bak filteret hos genene i analysepakke,
• Lite lavfrekvente deamineringer (tegn på fragmentering)
• God lav verdi på Median All Pairwise Differences (MAPD)/uniformitets verdi (Ion Torrent teknologi),
• Tilstrekkelig uttrykk av ekspresjonskontroller i RNA,
• Bra nok in-line kontroll (fragment sjekk) i mindre genpanel.

I tillegg henvises det til andre prosjekter i NorPreM; Harmonisering av varianttolkning og bruk av tolkningsverktøy (P-1-008)1 for vurdering av kvalitetsparametre (QC) og mer detaljert informasjon om tolkning av NGS.

Dersom prøven har dårlige kvalitetsmål som lav konsentrasjon, lav tumorandel, eller høy fragmenteringsgrad og/eller NGS kvalitetsmål er under anbefalt nedre grense for NGS-panelet, anbefales det å vurdere ny sekvensering, spesielt dersom det er ingen sekvenseringsfunn. Det bør undersøkes om analysen eventuelt kan utføres på en annen blokk. Alternativt kan usikre funn bekreftes med annen metode. Det kan være ulike grader av fragmentering i en prøve og funn må vurderes i forhold til dette med en kommentar ved utsvar eller behov for konfirmerende tester. Ved sterk fragmentering bør ikke en prøve med negativt resultat svares ut som negativ.

Ved rapportering av usikre resultater, inkludert villtype varianter med behandlingskonsekvens som har for dårlig dekning, bør rapporten inneholde en forklarende kommentar tilpasset konteksten der usikkerheten kommer tydelig fram. F.eks.:

• “Inkonklusivt sekvenseringsresultat”

eller

• «Prøvematerialet er ikke av optimal kvalitet for NGS-analyse. Preparatet er cellefattig/har lav konsentrasjon og/eller tumorandelen under metodens anbefalte grense (< X %). Det er ikke gjenværende tumorvev i blokken etter sekvensering. Et negativt resultat kan derfor ikke utelukke tilstedeværelse av lavfrekvente varianter maskert av lav tumorandel. Estimering av eventuelle villtype varianter kan være lavere enn normalt, og kopitallsanalyser kan ikke tolkes pålitelig grunnet begrensninger i forhold til tumorandel krav for metoden.»

Usikre (lavfrekvente) funn bør bekreftes med alternative metoder om det er mulig. qPCR analyser er ofte tilgjengelig for vanlige mutasjoner. Siden disse analysene kopierer opp spesifikke muterte sekvenser er de mindre sårbare for lav tumorandel så lenge det er tilstrekkelig med muterte sekvenser til stede i prøven. For fusjoner eksisterer det også qPCR analyser, som f.eks. IDYLLA Gene Fusion fra Biocartis som dekker flere fusjoner som er aktuelle for ikke-småcellet lungekreft. FlSH kan være en aktuell metode for bekreftelse av fusjoner og kopitallsendringer, som er spesielt nyttig ved sparsomt materiale siden enkeltceller kan undersøkes.

Supplerende undersøkelser bør også vurderes om det mangler eller er for dårlig data fra sekvensområder av interesse (NO CALL områder). Ett hvert variantfunn som ikke møter visse krav blir satt til NO CALL. Dette kan representere sekvenseringsproblem som for eksempel mye bakgrunnsstøy, lav sannsynlighet for riktig basecalling for mutasjoner, strand bias mellom forward/revers strand under sekvenseringen, for lav sekvenseringsdekning og eller for stor variasjon mellom amplikoner for kopitalls vurderinger.

Det anbefales å overvåke lotnummer på reagenser og kvalitetsparametere fra sekvensering over tid. Dette kan lette feilsøking og øke sporbarhet, da enkelte problemer kan gjelde ekstraksjon eller hele sekvenseringen/bibliotek/chip/reagens lot etc., mens andre kun er prøveavhengig.9