Valg av biopsi til analyse er viktig for å sikre riktig diagnose og behandling. Metastaser kan ha utviklet nye genetiske endringer, aktuelle for målrettet behandling, som ikke var til stede i primærtumor. Bruk derfor alltid prøvemateriale som er mest relevant for pasientens nåværende sykdomsbilde.12

En sentral parameter som påvirker prøvematerialets egnethet for NGS-analyse, er korrekt vurdering av andel tumorceller.  For at mutasjoner skal kunne påvises med tilstrekkelig sikkerhet, må en viss mengde mutert DNA/RNA være til stede i prøven. Overestimering av tumorandel, særlig i prøver med lavt tumorinnhold, kan føre til falskt negative resultater, noe som har direkte konsekvenser for pasientbehandling. Tumorandel har også betydelig innvirkning på beregning av kopitallsvariasjon, ettersom denne parameteren inngår i algoritmene som estimerer antall genkopier.10 Den teoretiske beregningen av tumorandelen i et histologisk område baserer seg på kvantitativ celletelling. Dette innebærer at man identifiserer og teller antall neoplastiske celler (tumorceller) i forhold til det totale antallet celler med synlig cellekjerne i området etter følgende formel: Tumorandel (%) = (Totalt antall neoplastiske celler / Totalt antall celler med cellekjerne) × 100. Alle celler med cellekjerne i område valgt ut til vurdering må tas med i beregningen.3 I praksis baseres vurderingen imidlertid ofte på visuell estimering fremfor nøyaktig celletelling. Studier viser at vurdering av tumorandel har en høy grad av usikkerhet med store subjektive variasjoner.4111213 Det anbefales derfor bruk av standardisert prosedyre, regelmessig opplæring og kvalitetssikring.41112 For kvalitetssikring kan det benyttes eksterne kvalitetsprogrammer, som for eksempel «GenQA Tissue i- assessement modul», for vurdering av tumorandel og eventuell makrodisseksjon fra FFPE og ferskfrosset vev.14

Vurdering av tumorandel bør utføres av patolog. Om annet personell utfører vurderingen må de være godt opplært og ha patolog tilgjengelig for konsultasjon.45 Ved vurdering av tumorandel bør området som velges for analyse ha høyest mulig tetthet av intakte neoplastiske celler, og samtidig inneholde minst mulig andel inflammatoriske celler, stroma, nekrose, melanin og slim.4 Høy grad av nekrose kan føre til mislykket sekvensering som følge av deamineringer, artefakter og fragmentering. Siden inflammatoriske celler ofte er små og tettliggende er det lett å underestimere bidraget av normalt DNA/RNA til prøven som vil gi overestimering av tumorandelen. Melanin fra melanomceller kan i høye konsentrasjoner hemme PCR-reaksjoner.15 Det finnes ulike rensemetoder for å fjerne melanin.16 Det er imidlertid publisert studier som viser at melanin ikke påvirker mutasjonsanalyse som f.eks. ved bruk av  Idylla, som da kan benyttes som en alternativ metode.17  

Ettersom mange somatiske mutasjoner forekommer i heterozygot form, bør tumorandelen i prøven være dobbelt så høy som deteksjonsgrensen (spesifisert av produsent eller fastsatt ved intern validering) til den aktuelle mutasjonsanalysen.5 Makrodisseksjon anbefales i de fleste tilfeller der dette kan øke tumorandel med mindre hele snittflaten allerede har høy nok tumorandel med god margin. Enkelte genpaneler krever en høy tumorandel for å kunne korrekt beregne parametere som kopitallsvariasjon. Makrodisseksjon vil også øke sannsynligheten for å påvise mutasjoner som er til stede i subkloner. Ved små tumorområder kan mikrodisseksjon med f.eks. laser vurderes om slikt utstyr er tilgjengelig for laboratoriet.

Den vurdert tumorandelen bør dokumenteres i svarrapporten og inngå i den samlede vurderingen av analysens pålitelighet.84 Dersom tumorandelen er lavere enn det dobbelte av metodens deteksjonsgrense for mutasjoner bør resultater rapporteres med forbehold om at det er økt fare for falske negative funn (se Kvalitetsmål).

Kunstig intelligens har potensial til å vurdere tumorandel nøyaktig og konsekvent.181920 Ved digitalisering av snitt anbefales det bruk av digitale verktøy dersom det er tilgjengelig.

Langtidslagring av FFPE-materiale påvirker deaminering av nukleinsyrene og fragmentering. En kjent DNA-skade ved langtidslagring av DNA er deaminering av cytosin til uracil noe som kan gi artefakter som punktmutasjoner. Behandling med Uracil-DNA-glykosylase (UDG) vil kunne fjerne uracil fra DNA, men det kan også føre til tap av fragment.21 Erfaring fra laboratorier i Norge viser at eldre preparater (> 5 år) ofte har mer fragmentert DNA og er av for dårlig kvalitet til å kunne utføre NGS, mens det i litteraturen er funnet en grense på 7 år for DNA og 4 år for RNA (magekreft og kolorektal kreft).9 Det er viktig å være oppmerksom på begrensningene ved langtidslagring av FFPE-materiale. Dersom det er utført NGS med eldre preparater uten funn anbefales det å be om ny biopsi.

Følg leverandørs anbefalinger for antall vevssnitt, tykkelse/vevsareal og bruk av makrodisseksjon.  Antall snitt må også sees i sammenheng med biopsistørrelse, tumorandel og type prøvemateriale (pleuravæske kan f.eks. ofte ha lite tumorceller). Ulike ekstraksjonsmetoder har ulik sensitivitet for input av vev. Både For mye og for lite vev i ekstraksjonen fører til redusert DNA/RNA-konsentrasjon, som kan resultere i at utbyttet blir for liten i henhold til hva NGS metoden krever av input. Avvik fra produsentens anbefalinger bør derfor valideres internt. Flere laboratorier har gode erfaringer med bruk av tabeller, som angir anbefalt antall snitt ved gitt vevsareal, fra produsentenes ekstraksjonsprotokoller.

Snittet som brukes til å vurdere tumorandel må være representativt for det vevet som er igjen i blokken. Det siste immun-snittet kan benyttes framfor HE-snitt om det er mer representativt. Det anbefales å ta et ekstra HE-snitt etter uttak til NGS-analyse for å sjekke om tumorandelen har endret seg. Om tumorandelen har blitt markant lavere er det risiko for at man har mye mindre input enn det metoden anbefaler og det kan resultere i falske negative/falske lavfrekvente resultater. Det kan også være behov for å justere tumorandel i forhold til riktig beregning av kopitallsvariasjon. Om det ikke er tumorceller til stede i kontrollsnittet tatt etter uttak til NGS-analyse, bør det tas høyde for at den reelle tumorandelen kan være langt lavere enn først antatt, og resultatene må tolkes deretter.

For hver omgang med snitting må mikrotomet stilles inn på nytt og snittoverflaten skjæres ren. Dette medfører tap av materiale og det er fare for å snitte seg ut av tumorområdet. Det anbefales derfor å snitte i så få omganger som mulig for å unngå tap av tumorvev, spesielt for blokker med lite materiale. Når det snittes til molekylære analyser er det viktig at den som snitter følger rutiner for å unngå kontaminering mellom blokker. Det er viktig å ha et system på rekkefølgen av snitt, for å kunne følge utviklingen av tumor nedover i blokken. F.eks. ved bruk av vannbad med flere snitt på samtidig. Rekkefølgen må også komme tydelig frem ved bruk av digital patologi. I tilfeller der det ikke er tilstrekkelig materiale til både immun- og molekylære analyser er det patolog sitt ansvar å prioritere.